自2019年新型冠狀病毒（以下簡稱新冠）被發現以來，新冠疫情在全世界持續蔓延，全球感染例數不斷攀升。為有效應對疫情，世界各國都在加緊新冠疫苗的研發，到目前為止，美國、英國、中國、歐盟等國家和地區，已相繼批準多個疫苗用于人群接種。
引言：自2019年新型冠狀病毒（以下簡稱新冠）被發現以來，新冠疫情在全世界持續蔓延，全球感染例數不斷攀升。為有效應對疫情，世界各國都在加緊新冠疫苗的研發，到目前為止，美國、英國、中國、歐盟等國家和地區，已相繼批準多個疫苗用于人群接種。
在疫苗臨床有效性的評價中，疫苗保護效力（即評價接種疫苗后所預防疾病的發病率下降百分比）是最為關鍵的評價指標。同時，中和抗體的檢測對于評價疫苗接種后人體免疫應答水平等也起到非常重要的作用。這里所說的中和抗體檢測主要指基于體外培養病毒進行的中和試驗。
伴隨著疫苗的研究和上市，多家研究機構和生產企業致力于采用體外診斷試劑進行中和抗體檢測的研究，且預期用途與疫苗有效性評價有關。體外診斷試劑能否進行中和抗體檢測，能否用于疫苗效果評價等相關問題引發了行業高度的關注和討論。我中心針對這一問題進行了多次調查研究，并召開專家研討會，征求相關行業專家意見。參與討論的專家包括了疫苗研發、疫苗評價、中和抗體試驗研究和評價、臨床醫生、傳染病預防控制、臨床檢驗等各個相關領域的專家。現將目前調研結果總結如下。
一、新冠中和抗體的作用機制及主要類型：
中和抗體是由病毒最外層的包膜或衣殼抗原刺激機體產生的一類能與病毒結合并使之喪失感染力的抗體。病毒侵入人體后，體內漿細胞會產生病毒特異性抗體，其中只有一部分是中和抗體。
中和抗體作用機制一般包括改變病毒表面構型；與吸附有關的病毒表位結合，阻止病毒吸附，使病毒不能侵入細胞進行增殖；與病毒形成免疫復合物，易被巨噬細胞吞噬清除；有包膜病毒的表面抗原與中和抗體結合后，激活補體，可導致病毒的溶解。
目前針對新冠病毒的中和抗體是研究的熱點，不同的研究小組應用各種篩選方法篩選出大量針對新冠病毒的中和抗體，這些抗體大致可以分為以下幾類：
1.針對S1蛋白的受體結合域（RBD）
針對S1蛋白RBD的中和抗體可以與新冠病毒RBD區域結合，阻斷RBD與ACE2受體結合，從而阻斷病毒侵入人體細胞。針對RBD的中和抗體是人體產生的最主要、種類最多、對病毒阻斷活性最高的一類抗體。
2.針對S1蛋白的N末端域（NTD）
有些中和抗體針對S1蛋白NTD區域，比如4A8等，能有效地中和新冠病毒。2021年1月發表于Cell Research的一項研究顯示，人體細胞上的酪氨酸蛋白激酶受體UFO（AXL）與NTD區域特異性結合，可能是潛在的病毒感染細胞的受體，此項研究結論可以部分解釋NTD中和抗體能夠有效中和新冠病毒的原理。
3.其他
有研究報道了多株針對S1蛋白的中和抗體，但不能與RBD重組蛋白結合，也不識別NTD結構域，其中和機制還有待進一步研究。另有研究表明新冠肺炎康復者血漿存在能結合S2蛋白的抗體，相關研究報道較少。
綜上，中和抗體阻斷病毒感染可有多種途徑；目前的研究證實，針對新冠病毒的中和抗體可能的結合位點涉及多個蛋白結構域，且不排除還有新的未被發現的結合位點。
二、中和抗體檢測的“金標準”
中和抗體檢測是疫苗研發和臨床評價過程中重要的指標之一，中和抗體檢測的實驗室金標準是感染抑制試驗，主要包括利用活病毒進行的蝕斑減少中和試驗（plaque reduction neutralization test，PRNT）和通過檢測細胞病變（cytopathic effect，CPE）量來進行分析的微量細胞中和試驗。這兩種方法均使用定量的活病毒與不同稀釋度的等量血清混合后，接種預先準備好的單層細胞，通過不同的指標評價細胞的病變程度評價中和抗體效價。采用體外培養的活病毒進行的中和試驗反映的是人體血液樣本中能夠阻斷病毒感染的總中和抗體的效價。
中和抗體檢測方法需要經過嚴格的標準化過程和充分的性能評價，并通過確定適合的判斷界值（Cut-off值），建立與病毒保護力之間的相關性，確定最低保護水平。例如已經較為成熟的流感疫苗、EV71疫苗、狂犬病疫苗、脊髓灰質炎疫苗等，均已建立了WHO認可的標準化的中和抗體試驗，有相應的WHO標準品和推薦使用的標準毒株，并設定了明確的Cut-off值。其他疫苗，即使尚沒有國際公認的參考方法，各疫苗廠商也需要建立相對標準化的中和抗體試驗方法。
此外，對于新發突發烈性病毒性傳染病來講，由于活病毒株來源以及需在高等級生物安全實驗室操作的限制，越來越多的實驗室開始研發假病毒細胞培養的方法檢測中和抗體，該方法中假病毒的膜蛋白結構與活病毒相似，且不需要高等級生物安全實驗室，操作簡便，結果判斷客觀；但該方法同樣需要標準化且應與活病毒培養的方法進行驗證。
專家廣泛認為，以上PRNT、CPE和假病毒中和試驗是病毒疫苗評價中最常用且最經典的三種中和抗體檢測方法。方法學可靠，但需嚴格的標準化過程。
針對新冠病毒，國內外多個研究機構和生產企業都在致力于研究基于活病毒或假病毒的中和抗體檢測方法，其中也包括WHO的專業實驗室，但由于新冠疫苗研發的周期較為有限，相關基礎研究仍然不夠，加之突變株的不斷出現，到目前為止還沒有建立起標準化的中和抗體試驗方法；各家機構建立的試驗方法之間也存在不小的差異。
三、基于酶聯免疫等方法的中和抗體檢測試劑研發情況
目前，國內外很多科研機構和企業將中和抗體檢測試劑作為研發方向，進行了很多探索。一般是基于單抗原表位或多抗原表位采用競爭抑制原理的酶聯免疫法進行中和抗體檢測。產品擬定預期用途與疫苗接種后有效性評價有關。
針對此類產品的研發和臨床定位尚存在以下主要問題：
1.試劑需要選擇一個或多個抗原表位進行中和抗體檢測，而抗原表位的選擇決定了檢測到的抗體是否中和抗體，以及能夠起到保護作用的中和抗體是否都被充分檢測到了。目前新冠病毒的基礎研究尚不充分，中和抗體可能涉及病毒表面的多個蛋白結構域；且有研究表明在疫苗接種后的不同時間階段，中和抗體譜可能會發生變化，例如中和抗體中RBD抗體和NTD抗體的比例可能發生變化；同時病毒抗原表位的變異頻頻出現，且規律尚不明確。因此，無論是單個表位還是多個表位的檢測產品，均不能確保覆蓋所有中和抗體。且不同的疫苗在工藝路線上的差異，導致產生的中和抗體也不同，這些差異帶來的不確定性使得試劑在中和抗體表位的選擇上很難達到很好的代表性和覆蓋程度。
2.體外檢測中和抗體的濃度值與疫苗保護效力的相關性尚缺乏充分的臨床證據，無法建立可靠的Cut-off值。在沒有可靠的Cut-off值的情況下，試劑檢測結果很難用于描述疫苗的保護力，不能給臨床提供有明確價值的判斷和結果提示，即陽性不代表一定有保護力，而陰性或弱陽性也不能說明一定沒有保護力。
現階段已經有一些正在研究的項目，試圖采用建立的體外診斷試劑與體外培養活病毒的中和試驗進行對比研究，從而建立一個有效的Cut-off值，確立體外診斷試劑檢測中和抗體的性能。但是，此類研究中所采用的對照方法“體外培養病毒的中和試驗”尚且沒有建立公認的標準化方法，因此比較研究的結論缺乏可溯源和可協調一致的基礎。
可見基于現階段的研究情況，體外診斷試劑檢測中和抗體無論是在方法學的標準化方面還是Cut-off值建立方面都缺乏充分的研究和論證。
3.體液免疫并不是疫苗接種后產生保護力的唯一途徑，除了中和抗體（體液免疫）之外，細胞免疫等其他免疫途徑也同時發揮作用。因此接種疫苗后中和抗體滴度水平低或者檢測陰性，并不能明確得出沒有保護力的結論。對疫苗保護力的評價應結合體液免疫與細胞免疫等進行綜合判斷。
4.疫苗評價是從群體的角度判斷能否實現一定的保護率，從傳染病防控的角度證明疫苗能夠有效阻斷病毒的傳播，而不是針對每一個個體判斷疫苗是否有效。保護力的研究結論來自疫苗上市前及上市后大規模的臨床研究數據。因此在沒有充分數據支持、且新冠疫苗免疫機理研究及中和抗體中和機制研究尚不透徹的情況下，針對疫苗接種個體進行中和抗體檢測，既不能給疫苗評價提供有效的支持，也不能給接種者個體提供有效的信息，不具備顯著的必要性。
四、小結
綜上，在疫苗研發和有效性評價的過程中，各種中和抗體檢測替代方法的科學研究值得鼓勵；但是，作為體外診斷試劑管理的產品上市，應當建立在充分的基礎研究成果和充分的臨床證據的基礎上，應當符合法規規定的定義和用途。
標簽：體外診斷試劑注冊、體外診斷試劑生產許可證代辦、體外診斷試劑CE認證代辦